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블로팅 기술정보

웨스턴 블로팅

웨스턴 블로팅이란 샘플에서 특정 단백질을 검출과 정량화 하기 위하여 사용하는 분자생물학 테크놀로지입니다 . 단백질의 복합 혼합물 ( 예 : 세포 용해물 ) 에서 특정한 단백질을 분리하는 것으로 분자생물학 및 생명공학에서 널리 활용되고 있습니다 . GVS 사는 다양한 재질의 Transfer 멤브레인과 경쟁사에 비교하여 최고의 감도의 웨스턴 블롯 기질을 제공하고 있습니다 .

image1.png

웨스턴 블로팅 일반 시험 절차

Blocking 및 Transfer 에 사용되는 주요 용액과 시약


Running buffer 10X:

  • Tris base: 250 mM
  • Glycine: 1.90 M
  • SDS: 1%.

완충액의 pH 는 8.3 이어야 하며 pH 조정은 필요 없으며
실온에서 보관할 수 있으며 사용 전 희석을 합니다

Running buffer 1X:

  • 10% 10X Running buffer
  • 90% DW H2O

Tris Glycine buffer 1X:
  • 25 mM Tris bas
  • 190 mM Glycine
 Transfer Buffer:

20% MetOH
  • 0.25X Tris Glycine buffer

Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X:
  • 137 mM NaCl
  • 2.7 mM KCl
  • 10 mM Na2HPO4
  • 1.8 mM KH2PO4

PBS Tween (PBST) 1X:
  •l 0.05% Tween
  • 99.95% PBS

1X Blocking Buffer:
  • 5% skim milk (or Bovine Serum Albumin - BSA)



시험절차

단백질 분리를 위한 전기 영동

1. 전기영동에 적합한 SDS-Polycrylamide(SDS-PAGE) 젤을 준비합니다 .
단백질 크기에 따른 SDS-PAGE 겔의 종류 ; 단백질 크기가 작을수록 더 높은 농도의 젤을 사용해야 합니다 .
2. SDS-PAGE 젤의 Well 에 로딩할 샘플을 준비합니다 .
샘플 및 샘플 버퍼의 준비는 단백질 유형 및 제조업체의 권장 사항에 따라 다릅니다 .
3. 단백질 마커와 동일한 부피의 단백질 샘플을 SDS-PAGE 젤의 해당 Well 에 로드합니다 . 샘플 버퍼는 빈 Well 에 채웁니다 .
4. 전기영동 탱크에 완충액을 채웁니다 .
5. 다음 조건에서 젤을 실행합니다 .
  • 20-30 분 동안 120V( 또는 샘플이 스태킹 젤에 도달할 때까지 );
  • 30-45 분 동안 180V( 정전압하에서 단백질 분리 ).




단백질의 전기이동


1. PVDF 멤브레인의 경우 멤브레인 평형 (Equilibration) 을 다음과 같이 수행합니다 .
  • 1 분 동안 메탄올에 막을 담그고 ;
  • 이어서 5 분 동안 DW 물에 막을 담그고 ;
  • 그 다음 10 분 동안 Transfer Buffer 에 막을 담그십시오 .
  • 멤브레인은 항상 젖어야 합니다 .
2. 그림 1 에 제시된 구성표에 따라 트랜스퍼 샌드위치를 조립합니다 .
젤과 멤브레인 사이에 기포가 없는지 확인합니다 .
3. 카세트를 Transfer 탱크에 놓고 Electroblotting 탱크에 전송 버퍼를 채웁니다 . ( 샌드위치가 버퍼로 덮여 있는지 확인 ).
4. 얼음 수조에서 120V 에서 1 시간 동안 Electroblotting 을 실행합니다 . 실행 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다 .


Blocking 및 항체 배양


1. 실온의 Blocking 완충액에서 멤브레인을 1 시간 동안 배양하거나 일정한 교반과 함께 4°C 에서 Overnight 배양합니다 . 멤브레인의 활성면은 항상 용액과 접촉해야 합니다 .
2. 블롯을 1 차 항체 용액에 넣고 실온에서 1 시간 동안 교반하면서 배양합니다 .
용액은 멤브레인 표면을 가로질러 자유롭게 움직여야 합니다 . ( 항체 희석은 생산자 권장 사항에 따라 다름 ).
3. 멤브레인은 다음과 같이 세척합니다 .
  • 교반 하면서 10 분 동안 PBS- 트윈 (PBST) 에 담그고 ;
  • 교반 하면서 5 분 동안 PBS- 트윈 (PBST) 에 담그십시오 (2 회 ).
4. 2 차​​항체 용액 (HRP 접합체 ) 에 블롯을 놓고 , 실온에서 45 분 동안 교반 하면서 배양합니다 .
항체의 희석은 생산자 권장 사항에 따라 다릅니다 .
5. Blocking 및 항체 배양 섹션의 3 번 항목에 설명된 세척 단계에 따라 멤브레인을 세척합니다 .


화학발광을 통한 검출


1. 화학발광 기질의 1:1 혼합물을 준비합니다 (ECL HRP, 감도에 따라 Light Wave, Light Wave Plus 또는 Light Wave Max 선택 ).
2. 기질이 있는 용기에 블롯을 놓고 3 분 동안 배양합니다 .
3. 멤브레인에서 과량의 용액을 제거합니다 .
4. 멤브레인을 블롯 development 폴더에 넣고 롤러를 사용하여 모든 기포를 부드럽게 제거합니다
5. 필름을 이미징 시스템에 노출시킵니다 .

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블로팅 Transfer 멤브레인 선정 가이드

블로팅1.png


검출시약 선정 가이드

블로팅2.jpg
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