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엔도톡신제거 필터와 LAL 테스트에 대한 소개

엔도톡신 제거 필터 PURAFIX ET-R

엔도톡신 정의와 제거필터

엔도톡신(Endotoxin)은 내독소라고도 하며 그람음성균의 세포벽을 구성하는 산성 리포다당류(LPS)의 복잡한 집합체에서 분해된 생성물입니다. 각각은 친유성 지질과 친수성 다당류로 구성됩니다. 인간에게 내독소는 열과 같은 면역 반응을 일으키며 박테리아와는 달리 엔도톡신(Endotoxin)은 열과 pH에 매우 안정적이므로 기존 멸균 방법으로 소멸시킬 수 없습니다. 단백질 정제 중에 엔도톡신의 감소는 가장 중요하고 어려운 단계 중 하나입니다. 크로마토그래피 공정은 엔도톡신 제거라는 측면에서 만족스러운 결과를 얻을 수 있지만 공정 후반에 오염 물질이 제거 해야하기 때문에 더 많은 비용이 소요됩니다.


엔도톡신구조.png

공정후반에 엔도톡신의 제거에 들어가는 비용을 최소화하기 위해서 PURAFIX® ET-R 심층 필터는 공정 초반에 엔도톡신 제거를 통해서 비용을 획기적으로 줄일 수 있습니다. 심층필터(Depth Filter)는 초기 정화단계(Early Clarification Step)에서 세포 배양 정화(Clarification) 단계까지 마이크론 단위의 입자들을 제거합니다.3차원 구조와 넓은 내부 표면적을 갖춘 심층 필터는 특정 오염 물질과 상호 작용할 수 있는 기능적 특성을 가지고 있으며 다운스트림 공정의 초기 단계에서 특정 오염 물질 감소와 기존 심층 여과의 입자 제거를 동시에 수행할 수 있어서 비용이 많이 드는 정제 단계를 최적화하여 시간과 비용을 절약합니다. 필터의 제거 메커니즘인 Size Exclusion으로 마이크론 단위의 오염물질을 제거하고 Adsorption으로 필터 매디아와 엔도톡신사이의 서로 다른 전하차를 이용하여 흡착을 통해서 엔도톡신을 제거합니다

PURAFIX® ET-R 심층 필터는 중성 pH 및 높은 염도 하에서 미크론 크기의 입자 제거와 내독소의 제거을 핳 수 있는 매커니즘을 갖추고 있습니다. 그람 음성 박테리아의 세포 또는 세포 찌꺼기 제거 시스템은 엔도톡신을 1,000,000 EU/mL에서 약 5000 EU/mL까지 줄일 수 있습니다. 이렇게 감소한 5000 EU/mL의 용액은 크로마토그래피를 이용하여 공정 후 단계에서 제거를 해야 하기 때문에 상당한 비용이 들어 갑니다.

PURAFIX® ET-R 심층 필터는 공정 초기 단계에 5000 EU/mL 양의 >95%를 제거할 수 있어 내독소 제거 공정단계를 획기적으로 줄일 수 있습니다. 다른 장점은 유연한 확장성을 갖춘 PURAFIX® ET-R 심층 필터는 실험실, 파일럿 스케일 및 생산 스케일의 동일한 재질의 다양한 형태와 사이즈의 제품을 제공하여 재질의 Performance의 Linearity가 보장되어 있으며 손쉽고 생산공정으로 Scale up을 할 수 있어 프로세스 개발에서 생산까지 합리적인 비용으로 확장할 수 있습니다. PURAFIX® ET-R 심층 필터는 실험실용 2인치 캡슐필터에서 부터 최대 16인치 Lenticular 모듈 필터 및 다양한 크기의 필터 시트가 제공되며 모든 제품의 재질은 동일하고 같은 검증 실험을 거쳐서 고객에게 제공됩니다

PURAFIX® ET-R 매디아 등급 선정

PURAFIX® ET-R 등급은 표적 분자의 다양한 크기, 전하 및 소수성정도에 맞게 설계되었습니다. 아래의 다이어그램은 표적 단백질의 크기, 친수성/소수성의 정도 여부 및 전하에 따라서 어떤 필터의 등급을 선정하여야 하는지 보여주고 있습니다. 친수성이고 양전하를 띠면 ET-R1 또는 ET-R2를 선택할 수 있습니다. 보다 소수성인 분자의 경우 ET-R1이 첫 번째 선택이 될 것입니다. 그러나 좀더 정확하고 안전한 선택을 하기 위해서는 2" 캡슐필터로 먼저 실험실에서 테스트를 권장합니다. PURAFIX® ET-R1은 표적 단백질이 작고 친수성일 때 엔도톡신을 제거합니다. 반면 PURAFIX® ET-R2는 표적 단백질이 중간 크기이고 양전하를 띠며 친수성일 때 엔도톡신을 제거합니다.

엔도톡신제거필터-단백질특성-1.png

PURAFIX® ET-R 심층필터는 마이크론 단위의 입자제거와 동시에 중성 pH 와 고염도 상황에서 엔도톡신 제거를 동시에 진행하는 장점이 있습니다. 공정 중간단계에서 원심분리, 분리, Acoustic Wave, 심층필터 및 기타 방법으로 생산된 용액의 엔도톡신 수치를 5,000 EU/mL로 줄여 줍니다.

어플리케이션

아래 그래프는 PURAFIX® ET-R와 경쟁 제품과 비교하여 EU/mL의 로그 감소를 나타냅니다. 수성액에서 PURAFIX®ET-R은 경쟁 제품보다 내독소를 훨씬 더 잘 제거합니다. PURAFIX® ET-R은 수용액에서 엔도톡신을 거의 100% 제거할 수 있습니다.

엔도톡신-3.png 엔도톡신-1.png

PURAFIX® ET-R 심층필터 시리즈

PURAFIX® ET-R 심층필터 시리즈는 실험실에서 생산공정까지 Scale-Up을 할 수 있도록 Test Kit부터 Sheet 필터까지 다양한 필터등급과 사이즈의 제품을 고객에게 공급하고 있습니다.

PURAFIX ET-R Product Series.png

엔도톡신 테스트(LAL Test)

그램 네거티브 박테리아의 세포벽에서 유래하는 엔도톡신은 투구게의 혈청을 이용하여 혈액응고반응의 원리를 이용하여 테스트를 합니다. 엔도톡신 테스트를 LAL 테스트라고 하는데 이는 투구게(Limulua)의 혈청(Amebocyte)의 응고효소(Lysate)로 테스트를 한다고 해서 Limulus Amebocyte Lysate 테스트라고 합니다.

LAL Test Process.png

LAL Test 종류



비색법(Chromogenic LAL Test)

• 비색법 시약은 투구게 혈구 효소(LAL), 소금, 버퍼, 발색 기질로 구성됩니다
• 인큐베이팅 기능이 장착된 튜브 판독기 또는 플레이트 판독기가 필요합니다
• 최대감도는 0.001EU/mL까지 측정할 수 있습니다
• 전자적 데이터와 결과 출력물을 제공하는 정량 분석 법입니다
• 샘플 희석을 통한 실험 간섭요인을 제거해야 합니다
• 405nm에서 빛을 흡수하는 샘플에 적합한 실험 법입니다
• 540nm-550nm에서 디아조 종말점 실험 법을 옵션으로 사용할 수 있습니다


비탁법(Turbidimetric LAL Test)

• 비탁법 시약은 투구게 혈구 효소(LAL), 사람 혈청 알부민(안정제), 소금, 다른 이온으로 구성됩니다
• 인큐베이팅 기능이 장착된 튜브 판독기 또는 플레이트 판독기가 필요합니다
• 최대감도는 0.001EU/mL까지 측정할 수 있습니다
• 전자적 데이터와 결과 출력물을 제공하는 정량 분석법입니다
• 샘플 희석을 통한 실험 간섭요인을 제거해야 합니다
• 340nm에서 빛을 흡수하는 샘플에 적합한 실험법입니다


겔화법(Gel-Clot LAL Test)

• 겔화법 시약은 투구게 혈구 효소(LAL)로만 구성됩니다
• 판독기는 필요 없으며 인큐베이터와 건식 Water Bath가 필요합니다
• 0.25,0.0125,0.06, 0.03EU/mL 등 다양한 감도의 시약을 사용할 수 있습니다.
• 육안으로 양성/음성을 확인하는 정성 분석법입니다
• 다른 실험법에 비교해서 간섭요인에 덜 민감합니다
• 미국, 유럽, 일본 약전에 있는 대부분의 샘플에 대한 "기본지표"로 사용됩니다
• 비색법/비탁법의 실험이 불명확할 때 "판단지표"로 사용합니다

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