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Virus Vector 분리 및 정제

바이러스 벡터의 정의

119.png 바이러스 벡터는 분자 생물학자가 유전 물질을 세포에 전달하기 위해 일반적으로 사용하는 도구입니다. 이 과정은 살아있는 유기체 내부(생체 내) 또는 세포 배양(체외)에서 발생할 수 있습니다. Virus는 자신이 감염시킨 세포 내부로 게놈을 효율적으로 운반하기 위하여 특수한 분자 메커니즘을 발전시켰습니다. 유전자 또는 기타 유전 물질이 벡터에 의해 전달되는 경우 이를 형질도입(transduction)이라고 하며 감염된 세포는 형질도입된 것으로 설명됩니다.




바이러스 벡터 응용분야

- 유전자 치료: 바이러스 벡터는 유전 질환, 암 및 기타 질병을 치료하기 위해 치료 유전자를 전달합니다.
- 백신 개발: 면역 반응을 자극하기 위해 바이러스 단백질이나 유전 물질을 도입하여 백신을 만드는 데 도움을 줍니다.
- 기초 연구: 과학자들은 바이러스 벡터를 사용하여 유전자 기능, 단백질 발현 및 세포 행동을 연구합니다.
- 신경과학: 벡터는 뇌 회로를 이해하고 신경학적 상태를 치료하는 데 도움이 됩니다.
- 세포 재프로그래밍: 세포 유형을 변환할 수 있습니다(예: 피부 세포를 뉴런으로 전환).
- 암 연구: 벡터는 항암제를 전달하거나 암 면역요법을 위해 면역 세포를 변형합니다.

바이러스 벡터 생산 스케일업(Scale-Up)

단일클론 항체와 기타 기존 단백질 기반 생물학적 제제는 일반적으로 현탁 세포 배양 공정을 사용하여 제조되는 반면, 유전자 생산 및 변형 세포 치료법에 필요한 일부 바이러스 벡터는 부착 세포 배양을 통해 생산됩니다. 치료 유전자를 전달하는 데 사용되는 일반적인 바이러스 유형 중 하나인 아데노바이러스 벡터의 제조에는 부착성 세포 배양에 의해 제공되는 조건이 필요합니다. 부착성 세포 배양에서 세포는 특정 유형의 매트릭스에서 지지되며, 가장 일반적인 두 가지 옵션은 마이크로캐리어와 다중 트레이 정적 플라스틱 제품입니다.

유리, 플라스틱(폴리스티렌, 아크릴아미드) 또는 천연 폴리머(콜라겐, 알지네이트)와 같은 재료로 만들어진 미세담체는 세포 성장을 촉진하는 특성을 가지고 있습니다. 부착된 세포에 대해 균질한 환경을 유지하기 위해 미세담체를 생물반응기에서 현탁하고 교반합니다. 그러나 바이러스 벡터 생산에 필요한 전단 민감성 세포의 경우 이러한 교반은 손상을 줄 수 있습니다. 또한, 생물반응기 내의 유체역학적 조건은 공정 부피에 따라 변하기 때문에 미세담체 공정의 규모 확대는 상당히 어려울 수 있습니다. 높은 세포 밀도를 달성하는 것은 종종 어려운 일이므로 성공적으로 규모를 확장할 수 있는 프로세스에는 일반적으로 대량의 값비싼 형질감염제가 필요합니다.

마이크로캐리어와 관련된 이러한 문제를 고려할 때, 아데노바이러스 벡터 생산을 위한 대부분의 부착성 세포 배양 공정에는 플라스크, 롤러 병, 큐브 또는 다층 세포 공정을 포함할 수 있는 정적 플라스틱 제품의 사용이 포함됩니다.

유전자 및 변형 세포 치료법의 광범위한 상용화는 어려울 것입니다. 그러나 실용적이고 확장 가능한 제조 플랫폼과 관련하여 아직 확립해야 할 부분이 많이 남아 있습니다. 바이러스 벡터를 생산하려면 먼저 적절한 세포를 성장시킨 다음 일반적으로 플라스미드 제제를 사용하여 형질감염시켜야 합니다. 그런 다음 바이러스 벡터는 세포에서 수확되어 유전자 치료로 직접 사용하거나 CAR-T 세포 치료와 같은 환자 세포의 약물 치료를 위해 제형화됩니다.

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바이러스 벡터 정화(Clarification)

바이러스 벡터를 제조하기 위해 일반적으로 배양 목적으로 두 가지 접근 방식이 채택됩니다. 즉, 2D 기반 부착 세포 시스템의 확장입니다. 다양한 유형의 생물반응기에서 평면 기술 및 3D 현탁 세포 배양 규모 확대. 업계에서는 무혈청 배지에서 성공적으로 성장할 수 있어 향상된 안전성 프로필과 제품 비용 절감을 제공할 수 있는 현탁 배양에 적합한 세포(예: HEK293)를 선호하는 것으로 보입니다. 다운스트림 처리는 숙주 세포와 배양 배지에서 발생하는 오염 물질을 제거하는 것을 목표로 합니다. 업계의 일반적인 추세는 확장성 및 노동 강도와 관련된 한계로 인해 원심분리와 같은 전통적인 정제 공정에서 벗어나는 것입니다. FILTROX BIO SD 시스템은 벤치탑에서 생산까지 선형 확장 가능한 프로세스를 통해 엄청난 양의 숙주 세포, 세포 잔해 및 오염 물질을 제거하는 데 사용할 수 있습니다.

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일반적으로 이러한 고밀도 배양은 유가식 모드로 실행됩니다. 생성된 세포 페이스트를 수확합니다. 예를 들어서 원심분리를 통해 세포를 물리-기계적(예: 균질화) 또는 화학적(예: 알칼리 용해) 처리로 용해합니다. 세포 잔해와 불순물을 제거하는 것은 정화 단계에서 어려운 일입니다. 효율적이고 확장 가능한 기술은 추가 정제 단계의 필요성을 최소화하는 데도 도움이 될 수 있습니다. 충적 여과는 이 단계에서 선택한 기술입니다.


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세포 포획(Cell Harvesting)을 위한 충적여과(Alluvial Filtration) 솔루션

118.png 대규모 생산공정에서는 세포포획(Cell Harvesting)을 두 단계로 진행하는 것이 효율적입니다. Centrifuge 와 충적여과의 조합 또는 큰 세포 및 세포 찌꺼기를 수확하는 1차 충적여과와 작은 세포 및 세포 찌꺼기를 수확하는 2차 충적여과 조합입니다. 이때 사용되는 충적여과 필터는 Filtrox사의 PURADISC 필터와 필터 보조제를 사용하는데 PURADISC ® BIO SD 시스템은 Refine된 Cellulose, 지력증강제, 습윤강화제, 합성섬유 또는 양이온화제를 혼합/반죽하여 자연건조하여 생산하기 때문에 메디아의 강력한 기계적 강도와 균질한 공극분포도를 가지고 있어서 강한 압력과 온도에 견딜 수가 있으며 입자 포획 능력이 탁월합니다.

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정제,농축,탈염을 위한 한외여과(ultrafiltration) 솔루션

121.png 세포 수확(Cell Harvesting) 이후에는 세포와 세포 찌꺼기가 제거된 단클론 항체가 포함된 용액을 한외여과(Ultrafiltration)로 단백질 분자량의 크기에 따라서 분리를 하는 정제(Purification), 정제된 각 분자량의 단백질 중에서 타깃 단백질에 대하여 원하는 만큼의 농도를 얻기 위한 농축(Conentration)과 버퍼 교환을 통하여 원하지 않은 작은 물질을 세척/제거 및 농도를 일정하게 유지하는 탈염(Diafiltration, Buffer Exchange)의 단계를 진행합니다. Membrane Solution 사는 TFF 방식의 한외여과 Hollow Fiber, 정밀여과 Hollow Fiber 및 TFF 방식의 한외여과 카세트를 공급하고 있으며 높은 품질이 검증되어 확실한 정제, 농축 및 탈염을 연구소, 실험실 및 파일럿 스케일에서 진행할 수 있습니다.

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미생물 감소 및 제균을 위한 일반 흐름 여과(NFF)솔루션

121.png 일반 흐름 여과는 카트리지필터와 캡슐필터에서 주로 사용하는 여과 방식으로써 Bio-burden 감소 및 제균 여과용으로 널리 사용됩니다. 제균여과용 필터는 다운스트림의 가장 말단에 위치하고 있으며 모든 미생물을 제거하여 생산제품의 안전성(Safety)을 보장하는 가장 중요한 역할을 합니다. 제균등급필터에 대한 검증은 B. diminuta균을 테스트 필터에 투입시켜서 필터의 하단부로 여과된 용액을 페트리디쉬에 접종하여 배양한 후 균이 한 마리도 발견되지 않으며 제균등급필터라고 합니다. 제균등급필터는 파괴 테스트인 bacterial challenge test와 비파괴 테스트인 Bubble Point 및 Diffusion Flow 완전성 테스트를 진행하여야 합니다. 제균등급필터는 엄격한 국제적 규정에 따라서 제작되어야 하며 GMP 수준의 공장에서 잘 검증된 SOP에 따라서 생산됩니다. Membrane Solutions 사는 이와 같은 모든 규정과 검증 절차에 맞게 최신 시설을 바탕으로 제균등급필터를 생산하고 있습니다.


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