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엔도톡신 제거 필터와 유전자 재조합 엔도톡신 시약

엔도톡신 검사 시약

투구게 혈액 채취

투구게 피뽑기.png엔도톡신 검사 시약은 전통적으로 투구게의 혈액 속 Amebocyte을 동결건조시켜 분말 가루로 만들어 사용을 합니다. 이와 같은 동물유래 엔도톡신의 종류에는 Gel-Clot LAL 시약, Turbidimetric LAL 시약 및 Chromogenic LAL 시약이 있습니다.

Gel-Clot LAL 시약은 정성 검사용으로 응고 정도에 따라서 검사 용액 내에 Endotoxin이 있는가 또는 없는가를 확인하는 시약입니다.

Tubidimetric 시약은 검사 용액의 탁도의 정도를 정량 검사하는 시약으로써 검사 용액이 탁도 측정의 간섭이 없는 경우에만 사용할 수 있습니다.

Chromogenic 시약은 검사 용액의 색상 강도 변화를 정량 검사하는 시약으로써 검사 용액이 색상이 없는 경우에만 사용이 가능합니다. 이 밖에 디아조 커플링 시약을 사용하여 색상의 강도를 검사하는 End-point 시약이 있습니다.

투구게는 쥐라기 시대의 모습이 거의 진화되지 않은 중요한 동물임에도 불구하고 어업과 LAL 시약 조제를 위하여 남획된 나머지 희귀 보호종으로 지정되었으며 이에 따라서 정해진 량만을 포획할 수 있기 때문에 시장 수요를 충족할 수가 없게 되었습니다. 유럽과 미국 식약청에서 동물유래 LAL 시약과 함께 유전자 재조합 엔도톡신 검사 시약의 동등성 평가를 통해서 승인을 하였기 때문에 동물유래 LAL 시약과 더불어 유전자 재조합 시약 역시 엔도톡신 검사 시약에 포함되게 되었습니다.

의약품 엔도톡신 최대 허용치(EU/mL)
주사용수(WFI) 0.25 EU/mL
인플레인자 타입 B 백신 50 EU/mL
면역 혈청 글로블린 0.91 EU/mL
LVP 0.5 EU/mL
Factor IX 0.1 EU/mL


엔도톡신 검사 시약 메커니즘

동물유래 엔도톡신 검사 시약의 메커니즘은 기본적으로 혈액응고 반응과 유사합니다. 엔도톡신과 엔도톡신 검사 시약이 반응을 하면 연쇄반응을 통해서 최종적으로 Proclotting 효소가 Clotting 효소로 변환 되면서 Coagulogen을 자극하며 Coagulin으로 변할 때 탁도를 정량 측정하면 Tubidimetric 검사라고 합니다. Coagulogen의 pNA와 활성 응고효소가 반응하면 노란색을 띠게 되는데 색상의 강도를 측정하면 Chromogenic 검사라고 합니다.

유전자 재조합 시약은 반응 메커니즘에 따라서 연쇄반응 시약과 Factor C 시약으로 구분을 합니다. 유전자 재조합 연쇄반응시약(rCR)은 동물유래 엔도톡신 검사 시약과 동일하게 연쇄반응을 하는데 최종적으로 Coagulogen의 pNA과 활성 응고효소와 반응하면 노란색을 띠게 되는데 색상의 강도를 측정하는 Chromogenic 검사만을 할 수 있습니다. 유전자 재조합 Factor C 시약(rFC)은 연쇄반응이 없으며 형광 기질(3종류의 시약)을 이용하여 Chromogenic 검사를 할 수 있습니다.

유전자 재조합 Factor C 시약(rFC)에 대한 국내 식약청 허가가 2022년에 완료되었습니다.

엔도톡신 검사 시약 메커니즘.png



엔도톡신 제거 뎁스필터의 메커니즘

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엔도톡신을 제거할 수 있는 필터에는 심층여과(Depth Filtration) 필터와 TFF여과(Tangential Flow Filtration) 필터가 있습니다.

수용액에서 내독소는 다양한 응집 상태로 존재할 수 있습니다. 개별 분자의 분자량은 ~10-20kDa인 반면, 응집체의 분자량은 1MDa에 달할 수 있습니다. Ca2+ 및 Mg2+와 같은 2가 양이온은 LPS의 응집된 구조를 안정화시키는 것으로 밝혀진 반면, 세제는 구조를 더 작은 하위 단위로 분해하는 데 도움이 됩니다. 이러한 크기 감소는 응집 분할의 결과입니다.

심층여과(Depth Filtration) 필터는 깊이필터라고도 하며 정제된 셀룰로우스(Cellulose), 천연 필터 보조제와 습윤 강화제를 혼합하여 기계적 강도가 높은 재질로 제작됩니다. 이와 같은 혼합 재질에 제품 모델에 따라서 합성섬유 또는 양이온화제를 추가하면 심층여과필터가 특정 단백질을 흡착할 수 있는 강한 양전하를 띠게 됩니다. 엔도톡신 역시 전하를 띠고 있는데 pH 2 이상의 용액에서는 음전하를 띱니다.뎁스필터 메디아와 엔도톡신이 상호 간에 작용을 하면 서로 다른 전하를 띠기 때문에 흡착 효과(Adsorption)가 발생하여 엔도톡신이 메디아 표면 및 내부에 달라붙게 되어 엔도톡신이 제거됩니다. 장점은 간편하게 사용할 수 있으며 운영비용이 적게 들면서 Chromatography 와 동일한 엔도톡신 제거 성능을 보입니다. 일회용으로써 교차 오염의 문제가 없습니다. 단점은 흡착 면적이 없어지면 엔도톡신 제거가 힘듭니다.

Depth필터 엔도톡신 흡착메커니즘.png



PRISM-1.png

TFF 여과(Tangential Flow Filtration) 필터는 크기베제(Size Exclusion) 메커니즘으로 엔도톡신을 제거합니다. 전통적으로 역삼투(RO) 또는 10KD MWCO의 한외여과막을 통해서 엔도톡신을 제거합니다. 만약에 엔도톡신 제거하려는 용액의 성분의 분자량이 10KD 이상이면 한외여과(UF) 방법을 이용한 크기베제 메커니즘은 작동하지 않습니다. 장점은 크기배제 방식으로 엔도톡신을 제거하기 때문에 일정하게 엔도톡신량을 제거할 수 있습니다. 단점은 초기 투자 비용이 높으며 TFF 멤브레인 모듈 가격이 굉장히 비쌉니다. 세척을 통해서 재사용이 가능하나 잘못된 세척은 역효과를 일으킬 수 있습니다.





TFF (2).png



의약품 TFF 멤브레인 분자량
(NMWL)		 용액 Permeability
(LMH/bar)		 엔도톡신 제거
주사용수(WFI) 10,000 27 >3
4% 아미노산 10,000 17 >3
10% 아미노산 10,000 25 >1
10% 아미노산 20,000 113 >1
30% 페니실린 10,000 45 >3
35% 조영제 10,000 3.4 >3
35% 조영제 30,000 8.7 >2
35% 조영제 100,000 13 >2
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